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病毒滅活試驗

作者:小編 更新時間:2023-08-03 點擊數(shù):

病毒,一類嚴格的細胞內(nèi)寄生物。在宿主細胞外環(huán)境,病毒既不能獨立進行代謝活動,也不能進行繁殖,只能以顆粒形態(tài)存在,即病毒體(virion)的形態(tài)存在。病毒死亡,由蛋白質(zhì)外殼的分裂和核酸退化導致的病毒濃度隨時間的降低。死亡的病毒不會感染宿主細胞, 因而喪失對人畜健康危害(沒有生物活性,不能主動進入細胞,也不能在細胞內(nèi)進行復制)。清除病毒的方法有很多,按病毒去除/滅活方式的不同,可分為有機溶劑/去污劑(S/D)法、低pH值孵放法、膜過濾法、紫外法、超短時微波加熱法、巴氏消毒法和干熱法等。咨詢電話: 13816144967 (微信同號)

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1. 有機溶劑/去污劑病毒(S/D)滅活法

過去,人們發(fā)現(xiàn)甲肝病毒能通過消化道傳播,乙肝病毒通常不能通過消化道傳播,但是在膽汁分泌障礙人群體內(nèi),乙肝病毒能通過消化道傳播的概率較高。后來,科學研究發(fā)現(xiàn),這與膽汁能溶解乙肝病毒的脂包膜有關(guān)。根據(jù)以上原理,通過研究和臨床觀察發(fā)現(xiàn),使用Triton-X 45這類的非離子型表面活性劑(去污劑)和磷酸三丁酯(有機溶劑)能夠有效破壞類似乙肝病毒的類脂膜:類脂從病毒表面脫落,使病毒失去黏附和感染細胞的能力,從而達到滅活病毒的效果,且對蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)的影響也非常小。這種方法就是有機溶劑/去污劑病毒(S/D)滅活法。

因S/D法具有較高病毒去除作用、蛋白相容性高、易于插入到現(xiàn)有或新開發(fā)的純化工藝中等優(yōu)點,人們便將這種滅毒方法用于血漿、血液制品和生物制品。S/D法作為血漿病原體滅活技術(shù),是最早得到醫(yī)療界的認可,并投入臨床中的。因為S/D法滿足了以下三點:①能完全有效滅活胞內(nèi)、胞外病原體及附著在細胞上的病原體;②所選試劑能選擇性地進入細胞且不損傷細胞;③經(jīng)處理后的紅細胞不產(chǎn)生新抗原或者抗體,對人體無害。因為S/D病毒滅活處理對多種不同的包膜病毒都能發(fā)揮有效的病毒滅活作用,且有良好的臨床安全性,因此其通過美國FDA許可,以用于濃縮的人血液Ⅷ因子的病毒滅活,并已廣泛用于生物制品的生產(chǎn)。

在工藝操作過程中需要注意:本方法對于無脂包膜類病毒作用微弱(僅部分非脂包膜病毒有效),但在工藝中的低pH(如pH 4)處理(有時加胃酶)能滅活幾種脂包膜病毒。除此之外,病毒滅活效果可能受pH值、孵放時間和溫度、胃酶含量、蛋白質(zhì)濃度、溶質(zhì)含量等因素影響。隨著pH升高,滅活效果降低,隨著溫度升高,滅活效果升高,通??梢赃_到5~6LRV滅活效果。在pH 3.7、pH 3.8時,其滅活效果會受多因素干擾。而樣品中含有一定量的精氨酸時可以改善病毒滅活效果,即使在pH 4.0的條件下也有顯著的滅活效果。低pH孵放不僅可以滅活有脂包膜類病毒,還可以沉淀HCP、DNA等雜質(zhì),對純化工藝中的雜質(zhì)去除也起到重要作用。咨詢電話: 13816144967 (微信同號)

2. 納米膜過濾技術(shù)

納米膜過濾技術(shù)是一種通過孔徑大小過濾來濾除病毒的技術(shù),多用于血液制品和生物制品中的病毒去除,其可以有效去除非脂包膜病毒。作為生物制品凈化過程中最常用的技術(shù)之一,其目的是達到有效的凈化效果,保證生物制品的安全。得益于生物治療產(chǎn)品如單克隆抗體、干細胞產(chǎn)品、血液成分、生物制劑和疫苗不斷增長的需求,未來幾年全球病毒過濾市場預計呈現(xiàn)增長的趨勢。

納米膜過濾是利用病毒和蛋白大小的不同,小于平均孔徑的蛋白通過濾膜,大于平均孔徑的病毒截留在膜內(nèi),從而達到去除病毒的效果。納米膜過濾可以同時滿足病毒去除效果好、目的蛋白質(zhì)通過性高(回收量、過濾時間)、目的蛋白質(zhì)不變性的特點,另外不管是脂包膜病毒還是非脂包膜病毒,無論病毒基因組是RNA還是DNA,基本靠孔徑大小來去除病毒,所以是當前最可靠的病毒去除、滅活技術(shù)。根據(jù)目的蛋白的大小,可以選擇平均孔徑不同的濾膜。在濾過產(chǎn)品中,平均孔徑為20 nm左右的產(chǎn)品被稱為細小病毒濾膜。近年來,由于去除小病毒的需求的提高,這種產(chǎn)品得到了廣泛的應用。其中平均孔徑35~50 nm的濾膜被稱為逆轉(zhuǎn)錄酶病毒濾膜。

在實際的生產(chǎn)過程中,為了提高蛋白回收率,需要暫停壓力,然后將流路切換到清洗緩沖槽進行后沖洗。病毒過濾的最劣條件之一是高TMP(跨膜壓差)。近年來的報告表明,過濾過程中壓力的釋放及之后的再加壓都會影響病毒去除效果。特別是在添加細小病毒和噬菌體進行的實驗中,在壓力暫停后再次加壓,會從濾液中檢測出病毒粒子。這種現(xiàn)象不是某種病毒濾膜所特有的,而是所有病毒濾膜產(chǎn)品的普遍現(xiàn)象。發(fā)生這種現(xiàn)象的原因在于,暫停壓力后,被截留在膜內(nèi)的病毒粒子會再進行布朗運動,離開膜壁,再次加壓后,附近若有粒徑較大的濾孔,病毒粒子又會通過而漏出膜外。當然,這不意味著病毒粒子一定會漏出。病毒漏出與否、漏出量取決于過濾對象溶液的性質(zhì)、過濾壓力、壓力暫停時間、病毒種類、病毒滴度/量和病毒濾膜的種類。咨詢電話: 13816144967 (微信同號)


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