病毒滅活效果驗(yàn)證測(cè)試方法

病毒保存液有兩種類型，一種是改良型裂解病毒蛋白提取核酸的滅活型保存液，一種是以運(yùn)送培養(yǎng)基為基礎(chǔ)改良的維持病毒體外活性、其核酸及抗原完整性的非滅活型保存液。常用的是滅活型保存液，高效滅活病毒，可以防止二次感染。咨詢電話: 13816144967 (微信同號(hào))

實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)：

參考《消毒技術(shù)規(guī)范》（2002版）病毒滅活試驗(yàn)中描述的檢測(cè)方法，確定病毒保存管滅活能力。

實(shí)驗(yàn)方法：

1. 細(xì)胞培養(yǎng)

將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HEK293T細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后稀釋至1×104/mL，按照100μL/孔的體積，每個(gè)梯度的病毒做三個(gè)復(fù)孔，計(jì)算所需接種孔數(shù)，將細(xì)胞緩慢均勻接種至96孔板中。放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。

2. 病毒稀釋

將病毒滴度為107-108TU/mL的病毒按10倍梯度進(jìn)行稀釋，連續(xù)稀釋3個(gè)梯度。咨詢電話: 13816144967 (微信同號(hào))

3. 病毒滅活

把稀釋好的病毒置于室溫條件下，與滅活款病毒保存液按1:1體積比進(jìn)行混合，置于室溫下分別放置1min、5min和10 min進(jìn)行滅活。

4. 終止滅活

采用病毒分離培養(yǎng)基（可用DMEM完全培養(yǎng)基替代）進(jìn)行1000倍稀釋以中和滅活保存液，終止滅活。

陰性對(duì)照：為病毒分離培養(yǎng)基對(duì)滅活款病毒保存液稀釋1000倍的混合液；

陽(yáng)性對(duì)照：為病毒分離培養(yǎng)基對(duì)病毒原液稀釋1000倍的混合液。

5. 病毒孵育

將事先培養(yǎng)的HEK293T細(xì)胞中吸棄細(xì)胞培養(yǎng)基，每孔加入100μL準(zhǔn)備好的病毒混合液，和對(duì)應(yīng)的陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照。病毒孵育3小時(shí)，每隔30分鐘從培養(yǎng)箱中取出晃動(dòng)一次。

6. 細(xì)胞培養(yǎng)

孵育結(jié)束后，將病毒液吸去，每孔中加入100μL DMEM完全培養(yǎng)基，將96孔板置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并觀察細(xì)胞狀態(tài)。

7. 熒光細(xì)胞觀察與計(jì)數(shù)

繼續(xù)培養(yǎng)48-72h，期間觀察細(xì)胞狀態(tài)，若細(xì)胞培養(yǎng)液變黃，應(yīng)換液，對(duì)熒光細(xì)胞個(gè)數(shù)適量的孔進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算病毒滴度。咨詢電話: 13816144967 (微信同號(hào))